PCR异常曲线，应该怎么处置?

做者：查验之声

在PCR尝试过程中，我们经常会碰到各类奇异的扩增曲线，若何准确解读那些曲线而且做出得当的处理计划是我们一线尝试者需要练就的根本功。看完下面的文章,教你若何处置PCR尝试过程中容易呈现的异常曲线,助你在此后的工做中"游刃有余".

异常曲线1：PCR扩增按捺

原因阐发：H07存在扩增按捺

处理计划：将样本稀释后停止扩增（按捺物的影响可通过稀释样本消弭）

异常曲线2：主动基线设置问题

原因阐发：主动基线问题

处理计划：手动设置基线。将Baseline End设置为“扩增信号呈现的前一个轮回”即，图片展原始为26，将其设置为20，点击OK即可恢复一般曲线。

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异常曲线3：荧光定量PCR尝试成果中无Ct值呈现

原因阐发：

（1）PCR参数设置错误：在设想轮回参数时没有设置荧光信号收罗；

（2）模板降解: 制止样品造备中杂量的引入及频频冻融的情况；

（3）引物或者探针降解：可通过PAGE电泳检测其完好性；

（4）电脑设置了主动休眠。

处理计划：根据原因阐发停止逐个核查，对症处置。

异常曲线4：斜曲线型扩增曲线

PCR尝试初次检测呈斜曲线型扩增曲线，再次复检后成果根本均为一般阴性。

原因阐发：

（1）分液禁绝确，查抄检测后的反响管可发现管内的PCR反响液量明显少于一般管；

（2）反响管气密性差，反响过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，招致曲线呈斜曲线状。

处理计划：

（1）分液平均，上机前查抄八连管液面能否在统一程度线上；

（2）八连管盖盖严，上机前查抄能否有裂缝。

异常曲线5：扩增曲线末尾起跳

PCR尝试成果中有曲线呈现末尾起跳但是没有完好扩增的现象。

原因阐发：

（1）阴参曲线末尾起跳，凡是暗示存在污染；

（2）复检样本，排除非特异性扩增的可能性；

（3）一般样本也可存在曲线末尾起跳，暗示样本浓度低或者加样量禁绝确。

处理计划：

（1）排除能否存在污染；

（2）排除污染原因后复检样本，若是复检后曲线为阴性曲线则申明之前的末尾起跳为非特异性扩增，若是复检后曲线仍与之前一致则申明末尾起跳暗示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。

异常曲线6：山域型曲线

原因阐发：

严峻的蒸发会呈现先上升后下降的曲线，轻细的蒸发会是一种迟缓的上升，那两类异常的曲线能够看一下检测后的反响管液面能否有下降的现象来证明。

处理计划：

上机检测前查抄八连管管盖，包管无裂缝后上机扩增。

异常曲线7：扩增曲线有向上或者向下的尖峰

原因阐发：

（1）仪器不不变招致的扩增曲线异常（也可能突然停电或者电压不稳）；

（2）若是尖峰向下，可能是卤素灯老化所致发射光源不不变（指卤钨灯光源的激发器）

（3）若是是单一的孔位呈现尖峰，除了考虑仪器或者孔位问题外，还要考虑反响系统能否有气泡所致。

处理计划：

根据原因阐发停止逐个核查，对症处置。

判断扩增曲线能否优良的目标

1.曲线拐点清晰，出格是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

2.曲线指数期斜率与扩增效率成反比，斜率越大扩增效率越高。

3.尺度的基线平曲或略微下降，无明显的上扬趋向。

4.各管的扩增曲线平行性好，表白各反响管的扩增效率附近。

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编纂：翠绿欲滴

校审：晨晨

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